原代細胞的培養方法 蒂科生物

原代細胞培養成功以后，需要進行分離培養，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養障礙，影響細胞生長。細胞由原培養瓶內分離稀釋后傳到新的培養瓶中培養的過程稱之為傳代培養。傳代細胞允許培養的細胞擴增(形成細胞株)，可以進行細胞克隆，易于保存，但可能喪失一些特殊的細胞和分化特征。傳代細胞形成細胞株的zui大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗。
1. 操作步驟
（1）吸掉或倒掉培養瓶內舊培養液。
（2）向瓶內加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養瓶底為宜。
（3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，2~5min后把培養瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發現胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。
（4）吸出消化液，向瓶內加入Hanks液少量，輕輕轉動培養瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養液。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養液，終止消化。
（5）使用彎頭吸管，吸取瓶內培養液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。
（6）用計數板計數后，分別接種于新的培養瓶中，置CO2培養箱中進行培養。
（7）細胞培養換液時間應根據細胞生長的狀態和實驗要求來確定。一般2～3d后應換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續傳代擴大培養或換成維持液。
2. 注意事項
（1）掌握好細胞消化的時間，消化時間過短時，細胞不宜從瓶壁脫落，過長的消化會導致細胞脫落、損傷。
（2）掌握好消化濃度，當消化液濃度過高時，消化時間應縮短，過低時細胞消化時間相對延長。
三、體內細胞培養及其操作步驟
1． 瘤細胞懸液接種
（1）無菌選取生長良好(有光澤，淡紅色)瘤組織或對數生長期培養瘤細胞。   
（2）在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨，經80～100目篩網過濾成細胞懸液。
（3）培養細胞應用PBS洗兩遍。
（4）計數并調整細胞濃度至107～108／ml。
（5）常規消毒后，于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫用注射器皮下潛行一段后注入細胞懸液(0.1ml／部位，＞106細胞)。初次接種成功率低，細胞數盡可能多一些。
（6）次日注意觀察動物一般情況。初次接種一般有一段較長的潛伏期，以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短，zui后固定為一個相對穩定的時間。
2． 腹水瘤的建立與腹水瘤的接種　將實體瘤細胞直接種于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤細胞，將這種腹水反復傳代，即可成為腹水瘤。初次傳代時，腹水常呈血性(含大量紅細胞)，反復傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過程如下。
（1）將凍存或培養的腹水瘤細胞離心和洗滌，進行細胞計數。
（2）消毒動物，左下腹穿刺接種106腹水瘤細胞。
（3）接種腹水瘤細胞后約7~12d，待小鼠腹部明顯膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用9號針頭抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽3~5ml。
（4）抽取的腹水經3000rpm離心15min，收集上清，分裝凍存備用。
四、培養細胞的凍存及復蘇
細胞低溫凍存是培養室常規工作和通用技術。細胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。
1． 凍存細胞
（1）選對數增生期細胞(證明無支原體污染)，在凍存前1d換液。
（2）按常規方法把培養細胞制備成懸液，計數，使細胞密度達5×107／ml左右密度，離心，去上清。
（3）加入配制好的凍存液（培養液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養液中加入保護劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，可使冰點降低，使細胞內水分在凍結前透出細胞外。
（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m懸液。
（5）旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，做好標記。
（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min時間內，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促進冰晶形成。
操作時應戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷。
2. 復蘇細胞
（1）從罐中取出凍存管。
（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內完成。
（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養液。
（4）低速離心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培養液洗一次。
（5）用培養液適當稀釋后，裝入培養瓶37℃培養，次日更換一次培養液后，繼續培養。以后仍按常規進行培養。
凍存細胞數量要充分，密度應達到107／ml，在融后稀釋20倍時，仍能保持5×105／ml數量。

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